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      木薯產業是中國廣西壯族自治區的支柱產業之一,木薯的種植面積、產量均占全國的70%以上,中國每年木薯渣的產量約為30 萬t,而且每年以30%左右的比例增長。木薯渣是木薯加工淀粉和酒精后的副產物,干物質的主要成分為淀粉、纖維素及少量的粗蛋白質(CP),碳水化合物含量高,礦物質、微量元素和氨基酸含量豐富,而且價格低廉,是一種有開發潛力的新型飼料資源,但木薯渣在實際應用過程中存在水分含量高(新鮮木薯渣水分含量為80%~90%)、不易貯存、CP 含量低及適口性差等問題,導致其一直沒有得到很好的利用。
     目前,部分木薯渣用于生產酒精、飼料、栽培平菇等,絕大部分的木薯渣被丟棄,不僅浪費資源,而且對環境造成嚴重的污染。應用微生物混合固態發酵木薯渣,通過微生物和相關化學物質發生一系列復雜的生物化學反應,不僅可以**木薯渣中的CP 含量,改善其適口性,還可以全面的**木薯渣的營養價值。Okpoko 等研究表明利用鼠李糖乳桿菌、黑曲霉及兩者混合分別發酵木薯渣,與沒有發酵的木薯渣相比,發酵后的木薯渣粗纖維(CF)、粗灰分(Ash)和水分含量均顯著**,而碳水化合物和粗脂肪(EE)含量有所降低;黃達明發現采用酵母菌和霉菌混合培養,通過菌種間的協同效應**了對發酵底物的利用率,同時發酵底物的營養價值也得到了顯著的**;趙華等研究黑曲霉固態發酵對甘薯渣品質的影響,甘薯渣接種黑曲霉孢子1×106 個/g,料水比1:1.3,發酵溫度38 ℃,發酵4 d 時,CP 含量從6.37% **至9.14%;發酵后還原性糖含量從4.42% **至7.34%;EE 含量從2.71%升高至4.75%。應用微生物發酵木薯渣,菌株的選擇非常關鍵。許多研究表明,混合菌種發酵木薯渣比單一菌種效果好,菌種的選擇由單一菌種向混合菌種方向發展。目前研究的微生物品種及搭配非常有限,布氏乳桿菌、黑曲霉、熱帶假絲酵母、枯草芽孢桿菌與植物乳桿菌3 菌組合處理木薯渣的研究鮮有報道。本試驗以木薯渣為發酵原料,添加1% 尿素作為氮源,添加0.6%紅糖調節木薯渣的可溶性糖濃度,用3 菌混合固態發酵木薯渣,探索**佳木薯渣發酵條件,為木薯渣在飼料行業中的廣泛應用奠定基礎。
1材料與方法
1.材料
     新鮮木薯渣由廣西水牛研究所水牛種畜場提供,經65 ℃ 干燥成風干樣,干物質(DM)含量為25.95%,CP 含量為2.59%,中性洗滌纖維(NDF)含量為24.29%,酸性洗滌纖維(ADF)含量為20.04%。熱帶假絲酵母(Candida tropicalis ,CT)、黑曲霉(Aspergillus niger ,AN)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ,BS)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum ,LAP)及布氏乳桿菌(Lactobasillus buchneri ,LAB)均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心;尿素為市購。
MRS 的液體培養基(用于LAP、LAB 活化和菌液培養);MRS 固體培養基(用于LAP 和LAB 涂板計數);MEB 液體培養基(用于AN 和CT 的活化和菌液培養);MEB 固體培養基(用于AN 和CT 涂板計數);葡萄糖營養液(用于BS 的菌種活化和菌液培養)及葡萄糖營養瓊脂(用于BS 的涂板計數)。

1 .2　方法
1.2.1　試驗設計
     將LAB、AN、CT、BS 與LAP中3 種菌以1∶1∶1 體積比組合,共設5 個不同組合,分別為組合1:LAB+AN+LAP;組合2:LAB+CT+LAP;組合3:LAB+BS+LAP;組合4:AN+CT+LAP;組合5:CT+BS+LAP;本試驗除對照組設4 個重復(其中2 個重復用于測定發酵前木薯渣混合料的DM 含量),其他每個組設2 個重復,每個重復以100 g 干木薯渣為發酵原料,添加0.6%紅糖,調節木薯渣的可溶性糖濃度,1%尿素作為氮源,各混菌組分別添加5% (占木薯渣干物質的質量百分比)。試驗分組情況:空白組:木薯渣;對照組Ⅰ:木薯渣+尿素;對照組Ⅱ:木薯渣+尿素+紅糖;試驗組Ⅰ:Ⅰ1:對照組Ⅰ+組合1 混合菌;Ⅰ2:對照組Ⅰ+組合2 混合菌;Ⅰ3:對照組Ⅰ+組合3 混合菌;Ⅰ4:對照組Ⅰ+組合4 混合菌;Ⅰ5:對照組Ⅰ+組合5 混合菌;試驗組Ⅱ:Ⅱ1:對照組Ⅱ+組合1 混合菌;Ⅱ2:對照組Ⅱ+組合2 混合菌;Ⅱ3:對照組Ⅱ+組合3 混合菌;Ⅱ4:對照組Ⅱ+組合4 混合菌;Ⅱ5:對照組Ⅱ+組合5 混合菌,各組微生物添加劑菌落單位情況見表1。
     各組均用生理鹽水調制含水量為65%左右,混合均勻,裝入聚乙烯薄膜袋中,用真空泵抽出袋內的空氣至真空狀態,密封,置于室溫下貯藏。從開始發酵之日算起,第10 天每組各開封2 袋,進行感官評定、pH、干物質回收率(DMR)、CP、NDF、ADF 等測定,以評價混合菌種發酵的效果。

1.2.2　試驗菌種的活化及擴培
     安瓿管凍干菌種,活化,按5%添加量接種到相應的液體培養基中,CT、AN 和BS 在30 ℃、150 r/min 搖床條件下培養,LAP 和LAB 37 ℃靜態培養。采用涂板對各菌種接種液進行計數。
1 .3　樣品采集與預處理
     開袋后,每袋取出35 g 樣品,放至250 mL 廣口瓶中,再添加150 mL 的超純水,放于4 ℃冰箱提取24 h,然后用2 層紗布過濾,濾液用于pH 和揮發性脂肪酸(VFA)的測定。剩余的木薯渣在65 ℃下烘干、粉碎(過40 目篩)制成風干樣,用于常規營養成分的測定。
1 .4　測定指標及方法
1.4.1　木薯渣發酵品質指標測定
1.4.1.1　pH
采用pH 計(HANNA HI 8424)進行測定。

1.4.1.2 　VFA 的測定
     取1.3 獲得的濾液0.5 mL,加入0.5 mL 8.2%偏磷酸,13 000 r/min離心10 min,再取上清液加入巴豆酸后,用氣相色譜儀(Agilent 7890A 型)測定樣品中乙酸、丙酸、丁酸的含量。毛細管柱:HP-INNOWAX (19091N-133);毛細管柱的規格:30 m×0.25 mm×0.25 μm。

1.4.1.3　DMR 的測定
     DMR(%)=(開封時木薯渣質量×木薯渣干物質率)/(裝袋時裝入木薯渣的質量×木薯渣原料干物質率)×100%。

1.4.2 　常規營養成分評定
     采用常規測定方法[18]測定樣品中的DM、CP、NDF 和ADF 含量。

1.4.3　木薯渣發酵料感官評定
     參考中國農業部1996 年發布的《青貯飼料質量評定標準(試行)》進行木薯渣發酵料感官評定,通過氣味、色澤、質地和霉變等情況評定,感官評定標準見表2。按照Kaiser 等提出的新的青貯飼料發酵品質評定標準,以乙酸和丁酸的含量來評價發酵飼料等級,標準見表3。
1.5　數據分析
     試驗數據先使用Excel 軟件進行初步整理,使用SPSS 17.0 進行方差分析和Duncan 氏多重比較,試驗數據采用平均值±標準誤表示,以P <0.05作為差異顯著性判斷標準。
2結果與分析
2.1 不同微生物添加劑組合對木薯渣發酵品質的影響
     由表4 可知,各試驗組的pH 均顯著低于空白組和對照組(P <0.05)。其中,Ⅰ4 組pH **低,空白組pH **高,空白組與對照組差異不顯著(P >0.05);各組乙酸含量差異均不顯著(P >0.05),其中,Ⅱ1 組乙酸含量**高,對照組Ⅱ乙酸含量**低。空白組、對照組和試驗組Ⅰ均未檢出丙酸,試驗組Ⅱ均檢出丙酸,但組間差異不顯著(P >0.05),其中Ⅱ2組丙酸含量**高,說明同時添加相應的菌種、尿素和紅糖有利于產生丙酸。各組丁酸含量差異均不顯著(P >0.05),其中,對照組Ⅰ丁酸含量**高,對照組Ⅱ丁酸含量**低。
2.2　不同微生物添加劑組合對木薯渣營養成分的影響
     由表5 可知,空白組DMR **高,顯著高于其他組(P <0.05),對照組DMR 次之且顯著高于試驗組Ⅰ和Ⅱ(P <0.05),Ⅱ5 的DMR **低。各試驗組的組間NDF 和ADF 含量差異均不顯著(P >0.05),均顯著低于空白組和對照組(P <0.05),其中,Ⅱ1組的NDF 和ADF 含量均**低,對照組Ⅱ的NDF和ADF 含量均低于對照組Ⅰ,但差異不顯著(P >0.05);試驗組和對照組的CP 含量均顯著高于空白組(P <0.05),為空白組CP 含量的1.7~1.9 倍,說明添加尿素能顯著**發酵木薯渣CP 含量。除Ⅰ1組外,各試驗組的CP 含量也均顯著高于對照組(P <0.05),其中,Ⅱ5 組的CP 含量**高。對照組Ⅱ的CP 含量顯著高于對照組Ⅰ(P <0.05),表明在木薯渣發酵過程中添加尿素+紅糖比只添加尿素更容易**CP 含量。
2.3　木薯渣發酵品質的評定
     不同微生物添加劑處理木薯渣發酵品質的感官評定結果見表6。由表6 可知,發酵10 d 后,空白組感官質量**差,開袋時有刺鼻酒酸味、色澤偏褐黃色,質量評分為28 分,其他各組感官評分均高于空白組,且開袋時均有甘酸香味,呈亮黃色,結構良好。除Ⅰ3 和Ⅱ3 組外,其他各試驗組的評分均高于對照組,均為49 分。對照Ⅱ的感官評分低于對照組Ⅰ。乙酸反映發酵飼料有氧穩定性的高低,而丁酸則反映發酵飼料品質的優劣,以乙酸和丁酸含量評價木薯渣品質,結果見表7。由表7 可知,各組發酵木薯渣得分均為100 分,品質均達到1 級水平。
3討　論
  不同微生物添加劑組合對木薯渣發酵產物的影響
本試驗中各試驗組的pH 均顯著低于空白組和對照組,原因可能是這些菌類在發酵過程中大量生長繁殖且分泌出相應的水解酶系,導致發酵底物中產生大量的揮發性脂肪酸和醇類等,而這些揮發性脂肪酸基本都呈酸性,所以**終導致發酵底物pH顯著下降,這與黃金華等的研究結果一致。pH會影響微生物的生長繁殖及代謝產物的合成,一般優質發酵飼料的pH<4.2,本試驗各組的pH 均低于4.2,均達到優質發酵飼料的標準,只是添加尿素、紅糖和菌種更有利于降低發酵木薯渣的pH。
     本試驗中Ⅱ1 組即LAB+AN+LAP+尿素+紅糖乙酸含量**高,可能因為AN 能夠產生高活性復合酶系,能較好地降解發酵料中的淀粉和纖維等,為LAB 和LAP 的生長繁殖提供營養物質,紅糖提供可溶性糖,促進LAB 和LAP 的發酵,而LAB 發酵會利用1 mol 葡萄糖或果糖產生等摩爾乳酸、乙酸(或乙醇)和CO2 。乙酸有利于降低發酵底物的pH,**有氧穩定性,且對防止飼料有氧變質有至關重要的作用。
     3.2　不同微生物添加劑組合對木薯渣營養成分的影響
不同的菌種產酶的能力及種類不同,而且菌種之間存在協同或頡頏作用,混合菌發酵主要是通過菌種之間的協同作用,擴大對發酵底物的適應性,從而起到改善發酵底物品質的效果,因此,菌種的選擇及組合非常關鍵。龔仁認為AN 可產高活性淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶等復合酶系,因此在發酵過程中能夠較好地降解發酵料中的淀粉和纖維等,為混合發酵的其他微生物提供營養物質。而酵母菌在發酵前期可以利用發酵底物中的游離氨基酸、單糖等合成蛋白質,同時產生乙醇等物質,使發酵飼料具有一定的酒香味。BS 是一種益生菌,與AN 等有很好的協同發酵的作用。Keles等研究表明,在飼料發酵過程中,同型發酵乳酸菌能夠產生乳酸,降低pH,**有害微生物的生長,降低NDF 含量,增加CP 含量。但Lindsey等認為,異型發酵乳酸菌雖然會產乳酸,降低pH,但會增加WSC 的損失及降低DMR 含量。本試驗結果表明,各試驗組的NDF 和ADF 含量均顯著低于空白組和對照組,CP 含量高于空白組和對照組,其中,Ⅱ1 組即LAB+AN+LAP+尿素+紅糖降解木薯渣NDF 和ADF 的效果**好,Ⅱ5 組即CT+BS+LAP+尿素+紅糖**木薯渣CP 含量的效果**好,但各試驗組DMR 含量均顯著低于空白組和對照組,可能是因為本試驗所選的菌種相互之間存在較好的協同發酵作用。本試驗研究結果與趙華等、黃金華等研究結果一致。但趙華等用AN 發酵甘薯渣后,CF 的含量沒有降低,反而從9.64%升高到12.47%,這與本試驗結果相反,可能是由于木薯渣生產淀粉的過程中,淀粉提取的程度不同,從而導致木薯渣中纖維含量差異比較大。木薯渣含氮量較低,但微生物生長繁殖需要充足的氮源,所以,有必要在發酵底物中添加氮源。在發酵底物中添加無機氮源,通過微生物代謝可以轉化為菌體蛋白,能顯著**產物中的CP 含量。
本試驗除空白組外,其他各組均添加1%尿素,結果表明,添加了1%尿素各組的CP 含量均顯著高于未添加尿素的空白組,且為空白組CP 含量的1.7 ~1.9 倍,說明添加尿素能顯著**發酵木薯渣CP含量。
     飼料在發酵時微生物快速生長繁殖需要一定濃度的可溶性糖,因此保證一定濃度的可溶性糖對獲得優質發酵飼料非常重要。鄒彩霞等用微生物制劑和糖蜜來發酵木薯渣,結果表明5 kg 干木薯渣(調水分含量約60%)添加20 mL 菌液和40 g 糖蜜,發酵2 和3 d 后,香味較好,而且可消化有機物含量高。本試驗結果也表明,在木薯渣發酵過程中添加尿素+紅糖比只添加尿素對木薯渣營養成分改善效果好。

3.3　木薯渣發酵品質評定研究
     從感官評分方面來看,對照組和試驗組得分均高于空白組,說明添加有關微生物、尿素和紅糖有利于改善木薯渣發酵品質。該試驗結果與黃金華等研究結果一致。本試驗感官評定是參照中國農業部1996 年發布的《青貯飼料質量評定標準(試行)》來進行,該標準將pH、乳酸、氨態氮、乙酸、丁酸等作為青貯評分指標,但郭旭生等認為,pH、乳酸和氨態氮不適宜作為評定青貯飼料發酵品質的標準,因青貯飼料中的pH 和氨態氮不僅與青貯的牧草品種和化學成分有關,還與青貯發酵過程有關系。而乳酸與青貯中乳酸菌的發酵類型相關。Kaiser等提出按照乙酸和丁酸的含量來評價發酵飼料品質的標準,該標準不考慮pH、乳酸及氨態氮的含量,其中乙酸反映發酵飼料有氧穩定性的高低,而丁酸則反映發酵飼料品質的優劣,本試驗也通過Kaiser等提出的標準評價木薯渣品質,結果顯示,各組發酵木薯渣品質均達到1 級水平,雖然各組均檢測出丁酸含量,但因含量低,不影響木薯渣的整體品質。
4結　論

     ①當底物含水量為65%左右,尿素比例為1%,紅糖比例為0.6%,混合菌(LAB∶AN∶LAP=1∶1∶1)接種比例為5%,發酵時間為10 d 時,乙酸含量**高,降解木薯渣NDF 和ADF 效果**好;
     ②當底物含水量為65%左右,尿素比例為1%,紅糖比例為0.6%,混合菌(CT∶BS∶LAP=1 ∶1 ∶1)接種比例為5%,發酵時間為10 d 時,**木薯渣CP 含量效果**好;
     ③添加相應的菌種+尿素+紅糖發酵木薯渣有利于產生丙酸;
     ④在木薯渣發酵過程中添加尿素+紅糖比只添加尿素對木薯渣營養成分改善效果好,添加尿素,能顯著**發酵木薯渣CP含量。
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